The extracellular alkaline protease, AprP, isolated from Pseudomonas sp. KFCC10818 was degraded by autoproteolysis at high temperature. Two sites of autoproteolysis were identified as amino terminal of Ser307 and Ser331 by isolation of early autolysis products and amino terminal sequence analysis. These sites seemed to be located in an exposed surface loop by fitting the sequence to model for subtilisin BPN'. To enhance thermal stability of AprP, we replaced serine residues of these sites with aspartate residues by site-directed mutagenesis. However, the only S331D mutant of two mutants was successfully purified and characterized. This mutant enzyme had a Km value 2.4-fold and a Kcat value 2-fold smaller than wild-type as measured by hydrolysis of s-AAPF-pna at pH 10.5. The half-life of S331D mutant showed 1.5 and 2.4 times longer than wild-type at 55℃ and 60℃, respectively. Therefore, these results suggest that the change of autolytic cleavage sites enhance the thermal stability and catalytic efficiency of the enyme AprP by preventing from cleaving.
Pseudomonas sp. KFCC10818로부터 얻어진 염기성 단백질 분해효소, AprP는 높은 온도에서 자가분해에 의해 그 활성이 사라진다. 307번째 Serine과 331번째 Serine앞에서 자가분해가 일어난다 것을 아미노산 서열분석방법으로 알아냈다. 열안정성을 증진시키기위해서 Site-diredted mutagenesis방법으로 두개의 자가분해 위치에 있는 아미노산을 다른 아미노산으로 치환했다. 이렇게 얻어진 두개의 돌연변이 효소중 331번째 serine을 aspartate로 바꾸어준 S331D 돌연변이 효소만을 정제했다. 정제된 S331D 돌연변이 효소는 pH 8.5와 pH 10.5 에서 인공합성 펩타이드 기질의 가수분해에 있어서 wild-type에 비해서 증가된 촉매능을 보였을 뿐만 아니라 55℃와 60℃에서의 half-life를 조사한 결과 wild-type보다 각각 1.3배, 2.4배 증가됨을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 자가분해 위치를 변화 시킴으로써 자가분해를 방해하게 되고 그 결과 증가된 열안정성과 촉매효율을 얻을 수 있다는 것을 말해준다.