RNA polymerases can bypass certain nicks and gaps of DNA templates to certain extent during transcription. As a part of developing a novel DNA sequencing technology, we have quantitatively determined the efficiency of bypass and transcription by a single-subunit bacteriophage RNA polymerase over a nick of DNA templates located at various positions. Synthetic DNA template with an SP6 promoter were designed to contain one nick at a defined location on the lower template or upper coding strand of the DNA template. Hybridization of three synthetic oligomers, one of which was a full-length strand of 55 nucleotides, generated a template with a nick at a defined position. The entire length of the templates covers from the position -18 to +37, where transcription starts at +1 position. Nicks were designed to be located immediately downstream of -4, +1, +5, +9 and +19 on the upper strand, and +1, +6, +10, +14 and +24 on the lower strand. The hybridized templates with a nick at various positions were subject to transcription reactions by the bacteriophage SP6 RNA polymerase under the standard conditions. The effects of the nick on the transcription initiation and elongation efficiency were quantitatively measured as compared with the control DNA template without a nick. A nick located within the abortive initiation region (+1 to +6) either on the upper and lower strand stalled the transcription. A nick on either strand located downstream of the abortive initiation region, however, did not stop the elongation, although it appeared to reduce the transcription efficiency to some extent. Furthermore, production of transcripts and efficiency of bypass at a nick highly depended on the location of the nick.
RNA 중합효소는 전사과정 중에 template가 끊어져 있거나 gap이 있을 때에도 건너띌 수 있다. 우리는 끊어진 DNA 가닥을 이용하여 정량적으로 파아지 RNA 중합효소가 DNA 주형 다양한 위치에 nick이 존재할 때 얼마나 잘 건너뛰는지 그리고 전사되는 양이 얼마나 되는지 측정했다. 그러기 위해서 우선 SP6 전사촉진제를 포함한 합성한 DNA 가닥을 두 가닥 중에서 일정부위가 끊어진 부분을 포함하도록 만들기 위해 길이가 가장 긴 55개의 염기로 구성된 DNA 가닥을 포함한 합성된 3종류의 oligomer를 섞어서 hybridization을 수행하였다. 이 주형은 전사의 시작부분을 +1이라고 할 때 -18에서 +37까지 이중나선구조로 되어있다. 끊어진 위치는 위 가닥에서는 -4, +1, +5, +6, +7, +8, +9, +19이고 아래 가닥에서는 +1, +6, +10, +14, +24이다. 이렇게 해서 만들어진 이중구조의 주형은 SP6 RNA 중합효소를 이용하여 표준조건에서 전사실험을 하였고, 끊어지지 않은 DNA를 control로 이용해 전사개시와 진행에 nick이 어떠한 영향을 미치는가를 정량적으로 측정하였다. 그 결과 nick이 위 가닥과 아래 가닥 모두개시부분(+1∼+6)에 위치하면 전사가 멈춘다는 것을 알았지만 nick이 그 외의 부분에 있으면 전사효율은 약간 떨어지지만 전사진행은 멈추지 않는다는 결과를 얻었다. 그러므로 전사체의 생산량과 전사효율은 nick이 존재하는 위치에 크게 영향을 받는다는 사실을 알 수 있었다.
