(Part Ⅰ) It was recently reported that the α-helical content of the signal peptide of Escherichia coli ribose binding protein (RBP), as determined by circular dichroism (CD) and 2D NMR in trifluoroethanol/water solvent, is higher than that of its nonfunctional mutant signal peptide [G. Yi, B.-S. Choi, and H. Kim (1994) Biophys. J. 66, 1604-1611]. In the present investigation, the structures of the signal peptides of two revertant ribose binding proteins in the same solvent were determined also using CD and 2D $^1H$ NMR spectroscopy. CD results showed that both of these revertant signal peptides have an intermediate helicity between those of wild-type and mutant signal peptides, the helical content of the revertant peptide with higher recovery of the translocation capability being higher. On the other hand, the helix regions of the wild-type and the revertant peptides as determined by NMR were shown to be the same. This discrepancy may be due to the stability difference between identical helical stretches in wild-type and revertant peptides. A good correlation between the helical content of these four RBP signal peptides in TFE/water as studied by CD and their in vivo translocation activities was observed. It appears, therefore, that both the proper length of helix and the stability are of functional significance.
(Part Ⅱ) The interactions of the second RNA-binding domain of Drosophila melanogaster Sex-lethal protein (Sxl RBD2) with oligoribonucleotides, GUUUUUUUU ($GU_8$) and CUAGUG, the sequences present around an alternative 3' splicing site of the tra pre-mRNA ($GU_8$CUAGUG), were studied by using heteronuclear two-dimensional NMR techniques. The $^1H$ and $^15N$ chemical shifts of the backbone amide resonances upon titration of the Sxl RBD2 with each of these RNAs were recorded. It was found that the Sxl RBD2 can bind not only to the polyuridine tract, $GU_8$, but also to the downstream 3'-splice site sequence, CUAGUG, with similar binding affinities. In contrast, a non-specific sequence, $C_8$, did not bind to the Sxl RBD2. This result is consistent with the previous in vitro RNA selection and UV crosslinking studies that the Sex-lethal protein binds to the uridine stretch and the AG dinucleotide in the consensus sequence, $AU_nN_nAGU$. In both cases, chemical shift perturbations were significant for nearly the same amino acid residues including the two central β-strands formed by the RNP2- and RNP1-motifs with two highly conserved aromatic residues (Y214 and F256) in the middle. As the first RNA-binding domain of Sex-lethal (Sxl RBD1) characteristically has an aliphatic residue at one of the two corresponding positions (I128 and F170), the Y214 of the Sxl RBD2 was replaced by Ile by site directed mutagenesis. The $^1H$ and $^15N$ chemical shift perturbations indicated that $GU_8$ binds to the same interface of the mutant Sxl RBD2 as that of the wild-type Sxl RBD2, although its binding affinity was significantly decreased. On the other hand, the binding of the Sxl RBD2 to CUAGUG was nearly completely abolished by the Y→I mutation. Taken together, the present results indicate that the interface residues for binding with $GU_8$ and CUAGUG are much the same, but the role of the Y214 is clearly different between these two target sequences.
(part Ⅰ) 대장균 리보스 결합 단백질 (RBP)의 야생형 신호서열이 막투과 전이 기능을 수행할 수 없는 돌연변이 신호서열보다 a-helix양이 많다는 것이 CD (Circular Dichroism)와 2D NMR (2차원 핵자기 공명 분광법) 실험을 통해 최근 발표되었다. 본 실험에서는 두개의 복귀 돌연변이 신호서열들의 구조를 같은 용매조건하에서 CD와 2D NMR을 이용하여 분석하였다. CD결과에 따르면 두 복귀돌연변이 모두 야생형보다는 적고 돌연변이보다는 많은 α-helix 양을 갖고 있으며 막투과 전이능력이 더 큰 복귀돌연변이가 α-helix양도 더 많았다. 반면에 야생형과 복귀돌연변이 신호서열이 α-helix를 형성하는 부위는 같았다. 이러한 차이는 야생형과 복귀돌연변이 신호서열간의 α-helix 안정성의 차이에 기인한다. CD연구로 부터 산출된 TFE/물에서 형성된 4 종류 신호서열의 α-helix 양과 생체내 막투과 전이능력간에 높은 상관성이 있는 것으로 관찰되었다. 따라서 α-helix의 적당한 길이와 안정성이 신호서열의 기능에 중요한 것으로 추정된다.
(Part Ⅱ) 초파리 Sex-lethal 단백질의 2번째 리보핵산 결합 도메인 (Sxl RBD2)과 리보핵산과의 상호작용이 이종핵 2D NMR을 이용하여 연구되어졌다. 리보핵산으로는 tra pre-mRNA의 3' splicing site에 해당하는 서열인 $GU_8$ CUAGUG로부터 얻은 $GU_8$와 CUAGUG를 사용하였다. NMR을 이용하여 이들 리보핵산으로 Sxl RBD2를 적정하면서 아미드 $^1H$과 $^15N$의 chemical shift (화학적 이동 신호)를 측정하였다. Sxl RBD2가 $GU_8$ 뿐아니라 CUAGUG 서열에도 비슷한 친화력으로 결합하는 것을 알 수 있었다. 반대로 특이서열이 아닌 $C_8$은 Sxl RBD2와 결합하지 않았다. 이러한 결과들은 이전의 in vitro RNA selection실험과 UV crosslinking 실험의 결과와 일치하였다. 두 경우 모두 chemical shift perturbation (화학적 이동 신호의 변화)이 거의 같은 아미노산 잔기에서 나타났고 이 잔기들은 대개 RNP1과 RNP2 서열을 가진 두개의 중앙 β-strands에 위치하고 그 중에서도 가운데 있는 방향족 아미노산 (Y214와 F256)에서 큰 perturbation을 보였다. 이 2개의 방향족 아미노산에 해당하는 위치에 Sxl RBD1은 예외적으로 한 개의 방향족 아미노산 (I128와 F170)만 가지고 있기에 Sxl RBD2의 Y214를 Ile으로 돌연변이치환을 수행하였다. Chemical shift perturbation결과에 따르면 GU8의 경우 결합친화도는 감소되었으나 야생형 Sxl RBD2와 같은 결합위치를 형성하며 돌연변이 Sxl RBD2와 정상적으로 결합한다. 반면 CUAGUG의 경우 YRI 돌연변이로 인해 Sxl RBD2와 정상적으로 결합하지 못한다. 이를 종합해보면 $GU_8$와 CUAGUG 모두 Sxl RBD2와의 결합에 참여하는 아미노산 잔기는 거의 같으나 이 결합시에 Y214의 역할은 두 리보핵산 서열에 있어 명백히 다르다.
