Antimicrobial peptides have received increasing attention as a new pharmaceutical substance, because of their broad spectrum of antimicrobial activities and the rapid development of multidrug- resistant pathogenic microorganisms. The main obstacle to the wide application of antimicrobial peptides has been the lack of a cost-effective, mass-production method. A system was developed for the efficient expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli as tandem repeats.
Various-sized multimers of a gene encoding an antimicrobial peptide, magainin, were obtained with the gene amplification vector, pBBS1: larger multimers, up to about 108 copies, were constructed from the monomer by the sequential amplification procedure. The multimers were the most stable in E. coli D1210 among E. coli hosts examined for the stability of multimers.
A mass-production method for an antimicrobial peptide, buforin II, has been developed by fusing the antimicrobial peptide to an acidic peptide. Multimers of the acidic peptide-buforin II fusion protein were expressed at the very high level without causing damage to the cells. The presence of cysteine residues in the acidic peptide enhanced the expression level substantially by facilitating the interaction of the negatively charged acidic peptide and positively charged buforin II through aggregate formation in tandem repeats, thereby effectively neutralizing the positive charge of buforin II. Multimers of this fusion protein were expressed as inclusion bodies, and more than 100 mg of pure buforin II was obtained from 1 L of E. coli culture by cleaving the multimers with CNBr. Recombinant buforin II had an antimicrobial activity identical to that of natural buforin II.
Other approaches have been tried to further increase the expression of buforin II fused to the acidic peptide as tandem repeats by stabilization of long mRNA transcripts or more efficient neutralization of positive charges of buforin II through disulfide bond formation. The expression of large multimers was slightly increased by synchronized transcription-translation in E. coli, and was further increased by the coexpression of DeaD-box protein. In addition, the expression of multimers was substantially increased when they were expressed in trxB E. coli host in which disulfide bonds could be formed easily in the cytoplasm. Our results indicate that the antimicrobial peptide can be expressed successfully by tandemly multimerizing the fusion peptide of an antimicrobial peptide and an acidic peptide, along with using the DeaD-box protein and trxB E. coli mutant.
항균펩타이드는 항균활성 범위가 넓고 다른 항생제와는 달리 병원균에 대한 저항성을 유발하지 않는 특성으로 인하여 새로운 항생물질로서 주목을 받고 있다. 이와 같은 항균펩타이드는 적은 비용으로 대량생산이 가능한 방법이 없음으로 인해 그 폭넓은 이용이 제한되고 있다. 따라서 본 연구에서는 대장균 내에서 tandem repeat형태의 항균펩타이드를 효율적으로 대량발현시킬 수 있는 system을 개발하였다.
Gene amplification vector pBBS1을 이용하여 magainin 유전자의 multimer를 만들었을 때, sequential amplification 방법에 의하여 monomer로부터 108 copy까지의 multimer들을 얻을 수 있었다. 여러 가지 대장균 strain들에 대하여 이들 multimer의 안정성을 조사한 결과 D1210 strain에서 가장 높은 안정성을 보였다.
항균펩타이드인 buforin II를 산성펩타이드에 fusion시켜서 대량생산할 수 있는 방법이 개발되었다. 이와 같이 산성펩타이드와 buforin II 융합펩타이드의 multimer들은 세포의 성장을 저해하지 않으면서 매우 높은 수준으로 발현되었다. 산성펩타이드 내에 존재하는 cysteine residue들은 tandem repeat 내에서 aggregate를 형성하게 함으로써 음전하를 가진 산성펩타이드와 양전하를 가진 buforin II 사이의 상호 작용을 촉진하여 buforin II의 양전하를 효율적으로 중화함으로써 발현을 증가시키는 것으로 추정된다. 이들 융합펩타이드의 multimer 들은 inclusion body형태로 발현되었으며, 대장균 1 L 배양으로부터 CNBr 절단 후에100 mg이상의 순수한 buforin II가 얻어졌다. 이와 같이 얻어진 재조합 buforin II는 원래의 buforin II와 동일한 항균활성을 나타내었다.
길이가 긴 mRNA transcript의 안정성을 증가시키거나, disulfide bond 형성을 통한 buforin II의 양전하를 더 효율적으로 중화시킴으로써 산성펩타이드에 의하여 중화된 buforin II multimer의 발현을 더 증가시켰다. 대장균 내에서 synchronized transcription-translation에 의하여 길이가 긴 multimer 들의 발현이 증가하였으며, mRNA의 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 DeaD-box 단백질을 같이 발현시킴으로써 buforin II multimer의 발현이 더욱 증가하였다. 또한 cytoplasm에서 disulfide bond가 형성되는 것으로 알려진 trxB mutant 대장균 strain을 이용하여 multimer 들을 발현하였을 때, 발현이 매우 크게 증가되는 것을 볼 수 있었다. 이상의 결과로부터 항균 펩타이드를 산성펩타이드에 융합함으로써 tandem repeat 형태로 높은 수준의 발현이 가능하였고, 이를 DeaD-box 단백질을 같이 발현하거나 trxB mutant를 이용함으로써 더욱 증가시킬 수 있음을 볼 수 있었다.
