The gene encoding a microbial D-hydantoinase from thermophilic Bacillus thermocatenultus GH2 was cloned and expressed in Escherichia coli by its own promoter, and its nucleotide sequence was determined. The structural gene of D-hydantoinase consists of 1,416 nucleotides and encodes 471 amino acid residues with a calculated molecular weight of 51,8 kDa. The N- and C-terminal amino acid sequences deduced from the nucleotide sequence were coincident with those determined by Edman degradation and carboxypeptidase digestion of the purified enzyme from B. thermocatenultus GH2. To get insight the structure-function relationship and active domain, its tetrameric enzyme property was compared with those of dimeric enzyme from Bacillus stearothermophilus SD1 based on the primary sequences. The homology of amino acid sequences between two enzymes was shown as high as 92%, and the secondary structures were determined to possess a very similar content. Despite the extreme homology of the amino acid sequences, the oligomeric structure and substrate specificity were quite different. The native gel electrophoresis patterns of the D-hydantoinases in the presence of b-mercaptoethanol revealed a different oligomeric feature, showing that its monomeric state is still active but quietly unstable. Moreover, we found that the oligomeric structure of the enzyme affected on their substrate specificities.
From the comparison of the enzyme with those of previously reported D-hydantoinases and dihydropyrimidinases in a dihydropyrimidinase family, the primary sequence among the enzymes showed a considerable homology with about 24 %, and the similar ORF sizes were revealed. If the highly mismatching C-terminal regions were not considered, the overall homology was increased up to about 35 %. With the considerable homology, the rigidly conserved histidine residues and highly conserved four regions were founded, but the C-terminal regions were completely mismatched. From the analyses of the nested deletion sets for functionally minimal domain, almost all amino acid residues from the N-terminus to 390 are required to retain the enzyme activity, but highly mismatching C-terminal regions are catalytically non-essential. As a possible role of this mismatching region, a clue was inferred from the comparison of tetrameric hydantoinase of B. thermocatenulatus GH2 with dimeric enzyme of B. stearothermophilus SD1. From the hydropathy analyses and secondary structure predictions, we expected that the C-terminal regions could be important role for the biochemical and structural differences between two enzymes. We investigated this possibility with the C-terminal region-deleted mutant enzymes from two Bacilli. We also confirmed this possibility by studies with domain-exchanged and fused enzymes. These studies strongly suggest that the C-terminal region of residue from 390 to C-termini was catalytically non-essential. In addition, this region affected on its oligomeric structure, resulting the different substrate specificity ascribed by the different oligomeric structure.
To progress the understand the functional and evolutionary relationships, we aligned the amino acid sequences of the functionally related amidohydrolases including hydantoinases, dihydropyrimidinases, allantoinases, and dihydroorotases, all of them catalyze the hydrolysis of the cyclic amide ring. With the considerable homology among the enzymes, the rigidly conserved histidine residues were also founded, and the amino acid sequence Asp-X-His-X-His was identically conserved in the enzymes. From the metal dependency for activity and chemical modification,we expected that the histidine residues could be important role for the enzyme activity. We investigated this possibility by mutational analyses of the enzyme from B. stearothermophilus SD1. From the mutational results of four histidine residues(56, 58, 183, 239th), almost complete loss of the activity was observed, and the mutation to less conserved residue His296 did not cause significant loss of activity. As an approach to understanding the significance of the conserved amino acid sequence(-D-X-H-X-H-), site-directed mutagenesis was carried out. When an Asp was replaced by Ala and two His were substituted with Asn, an almost complete loss of the enzyme activity was observed, which implies that the conserved amino acid residues are critical for the catalytic activity of these amidohydrolases. Based on the substrates on which the enzymes are acting and the presence of the conserved residues, we here propose a cyclic amidohydrolase family which includes hydantoinase, dihydropyrimidinase, allantoinase, and dihydroorotase. Similar secondary structures and hydropathy profiles were also supported above suggestion.
고온균인 B. thermocatenulatus GH2 로부터 D-Hydantoinase 유전자을 포함하는DNA단편을 클로닝하고 밭현시킨후, 염기서열틀 결정하였다. D-Hydantoinase 유전자는471개의 아미노산을 구성하는 1,416개의 염기서열로 이루어져 있으며, 효소의 크기는 51,8 kDa이다. 염기서열로부터 결정된 N- 말단과 C-말단의 아미노산 조성은 원균으로부터 분리한 효소의, 각각의 말단과 일치하였다. 이 효소는 Tetramer 로 구성되어 있으며, 단백질의 일차구조틀 기준으로 효소의 생화학적 특징을 dimer로 구성된 B. stearothemophilus SD1 의 효소와 비교함으로써 구조와 기능의 상관 관계및, 활성과의 관계틀 규명하고자 하였다. 두 효소의 아미노산 서열은 92%이상의 높은 유사도틀 보이며 단백질의 이차구조도 대부분 일치하였으나, 효소의 oligomeric structure 와 기질특이성은 상이한특징물 보여준다. D-Hydantoinase 는 매우 불안정하기는 하나 monomer 상태에서도 활성을 나타냄을 β-Mercaptoethanol 존재하의 비변성 단백철 전기영동틀 통하여 확인할수 있였으며, 효소의 기질특이성과 oligomeric structure 사이에는 밀접한 연관이 있음을 알수 있었다.
기능적으로 유사하다고 알려진 microbial D-hydantoinases 와 mammalian dihydropyrimidinases 간에는 24% 정도의 유사도틀 지니나, 비슷한 크기의 ORF 로 구성되고 C-말단 부분을 제외하면 35% 정도의 유사도틀 보여준다. 더불어, 특정부위의 아미노산 조성이나 위치가 모두 일정함을 알수있었고, 390번째의 아미노산 이후의 경우에는 상당히 낮은 유사도틀 지님을 알 수 있었다. C-말단과 N-말단의 부위틀 순차적으로 제거한 변이 효소의 활성을 조사함으로씨 N-말단부위로 부터 390번째의 아미노산까지는 효소의 활성유지에 중요함올 알 수 있었다. 활성에 있어서 불 필요한 부위인 C-말단부위의 기능은 지극히 높은 유사도틀 지님에도 불구하고 상이한 단백질의 4차구조를 보여주는 Bacillus 유래의 두 효소의 C-말단의 비교를 통해 추론하였다. C-말단의 소수성도와 이차구조의 예측을 통하여 두 효소의 구조적인 차이가 C-말단에 기인함을 알 수 었었고, 이러한 가능성을 특정한 C-말단 부위틀 제거한 변이 효소와 C-말단부위틀 교환한 변이효소, 그리고 C-말단부위에 다른 단백질의 일정부위를 융합한 변이효소를 통하여 확인하였다. 결론적으로, C-말단 부위는 효소의 4차구조의 유지에 중요한기능을 담당하고, 효소의 표면에 위치하며 활성에는 불필요한 부위임을 확인하였다.
세포내에서의 기능과 진화적인 유연관계가 불 분명한 효소인, D-hydantoinase 의 기능과 진화적 유연관계틀 조사하기위하여, 기질의 구조나 활성이 유사하며 핵산의 합성이나 분해에 관여하는 활성올 갖는 dihydropyrimidinase, allantoinase, 그리고 dihydroorotase 등과의 단백질의 일차구조를 비교하였다. 비록, 일차구조에 있어서 유연관계는 약하게 조사되었으나, 득정부위의 아미노산으로 histidine의 위치가 모두 일치함을 알 수 있었으며, 특이적으로 Asp-X-His-X-His 순서틀 갖는 부위가 모두 존재함을 알 수 있었다. 이들 아미노산 잔기들의 활성에 대한 영향을 조사하기 위하여 histidine 과 aspartic acid 에 특이적으로 작용하는 화학물질로 변성시킨후 효소의 역가를 확인한결과 중요한 역활을 예측할 수 있었다. 보다 직접적인 방법으로 이들 부위를 site-directed mutagenesis 시킨후에 역가틀 측정한 결과 56번 Aspartic acid 와 histidine 잔기인 58, 60, f83, 239 번 아미노산은 활성에 결정적인 기능을 담당하는 것을 알 수 있었고, 각각의 기능을 기존의 보고된 결과와 비교하여 추론하였다. 이를 근거로 cylic amide ring 의 가수분해에 관여하는 효소들인 D-hydantoinase, dihydropyrimidinase, allantoinase 그리고 dihydroorotase 의 활성부위가 매우 유사할 수 인음을 생각할 수 있었다. 특이적으로 보존된 아미노산 잔기주변의 비슷한 이차구조와 소수성도는 이러한 가정을 지지하는 결과틀 보여주었다. 결과적으로, 이들 효소는 common ancestor 로 부터 divergent 하게 진화 했을 가능성보다는, 효소의 활성부위의 구조가 유사한 Convergent 진화의 가능성을 시사한다.
