To obtain increasement of industrial value by enhancement of thermostability, site-directed mutagenesis in an alkaline protease, AprP from Pseudomonas sp. KFCC 10818 was carried out. By sequence alignments with aqualysin I of Thermus aquaticus YT-1, sites for cysteine substitutions to form a disulfide bond in this protease, AprP, were chosen. Gly199 and Phe236 were replaced by cysteine residues in the enzyme by site-directed mutagenesis. The G199C/F236C mutant enzyme appeared to form a disulfide bond spontaneously in its expression and showed improved kinetic parameters compared to that of the wild-type enzyme for hydrolysis of an artificial synthetic substrate at pH 8.5 and pH 10.5. The half-life of the G199C/F236C mutant was found to be 2 - 4.8 times longer than that of the wild-type enzyme depending on experimental conditions. There was not any significant differences in the half-life of both enzymes when examined under reducing condition. These results suggest that the introduction of a disulfide bond by site-directed mutagenesis enhanced both of the thermostability and the catalytic efficiency of the enzyme.
증가된 열안정성을 얻기위하여 Pseudomonas sp. KFCC 10818로부터 얻어진 염기성 단백질분해효소, AprP에 site-directed mutagenesis를 수행하였다. AprP에 disulfide bond를 만들기위한 cysteine으로 교체하고자 하는 위치를 disulfide bond가 열안정성에 중요한 것으로 보이는 열안정한 염기성 serine protease의 일종인 aqualysin 1과의 아미노산 서열 비교로 결정하였다. Gly199와 Phe236을 cysteines으로 site-directed mutagenesis에 의해 바꾸었다. G199C/F236C 돌연변이 효소는 그 발현과정에서 스스로 disulfide bond를 만들어 내는 것으로 보이며, pH 8.5와 pH 10.5에서 인공적인 합성 펩티드 기질의 가수분해에 있어서 wild-type과 비교해 볼 때 증가된 kinetic parameter를 보였다. 여러 실험조건하에서 약 2-5배 길었다. 환원성 조건하에서 조사하였을 때에는 두 효소의 half-life에는 중요한 차이가 보이지 않았다. 따라서, disulfide bond의 도입에 의해 효소의 열안정성과 촉매효율이 증가됨을 알 수 있었다.
