Streptokinase (SK), an extracellular protein of hemolytic streptococci, is known to lyse blood clots by activating plasminogen to plasmin. SK activates plasminogen by the formation of 1:1 molar complex of SK-plasminogen, which serves as the activator of free plasminogen to form plasmin. It has been suggested that the N-terminal region of SK is important in SK function and that several residues in the N-terminal region are unrelated to plasminogen activation. To investigate the functional role of the N-terminal region of SK, three deletion mutants, in which 7 (SKΔN7), 13 (SKΔN13) and 20 (SKΔN20) amino acids from the N-terminus of SK were truncated, were generated. The purified SKΔN7 and SKΔN13 mutants were nearly as active as wild-type in plasminogen activation. However, the SKΔN20 mutant showed only 4% of specific activity compared to the wild-type SK. In equimolar mixture of plasminogen with SKΔN20, the appearance of maximal amidolytic activity for the SKΔN20-plasminogen complex was observed after incubation for 4 min. The maximal amidolytic activity was not delayed compared to that of wild-type SK, indirectly showing that the deletion of 20 amino acid residues from the SK N-terminus did not reduce the binding affinity to plasminogen. To identify the individual amino acid residues of SK that induce activator function in plasminogen, ten site-directed mutations, S16A, S16L, Q17A, Q17L, L18A, L18Q, V19A, V19Q, V20A and V20Q, were introduced at the region of SK, Ser16-Val20. The data showed that eight SK mutants involving positions 16 (S16A and S16L), 17 (Q17A and Q17L), 18 (L18A and L18Q) and 20 (V20A and V20Q) were nearly as active as the wild-type SK in plasminogen activation. However, the V19A and V19Q mutants showed about 50% and 30% of plasminogen activation compared to wild-type SK, respectively. Three site-directed mutations, V19L, V19D and V19H were newly obtained to characterize the functional role of Val19 in plasminogen activation. The plasminogen-activating activities of V19A, V19Q, V19L, V19D and V19H SK were reduced to 57, 32, 85, 18 and 22% of the wild-type SK, respectively. Although five mutants in equimolar mixtures with plasminogen had lower maximal amidolytic activities than wild-type SK, the same incubation time (4 min) was required to reach maximal amidolytic activities. The Valine-19 mutations of SK described here caused no significant changes of the solution structure of mutant proteins compared to the wild-type SK, as revealed by CD spectroscopy. These results showed that the uncharged alkyl group side-chain on the 19th amino acid residue of SK is important for the activation of plasminogen.
On the other hand, The introduction of a plasmid containing skc (SK-coding gene) fused with ompA signal sequence into Escherichia coli K-12 strains, rendered the bacteria mucoid. Measurement of the synthesis of b-galactosidase from a cps-lacZ fusion (lacZ fusion to a gene necessary for capsule synthesis) showed that the mucoid phenotype was due to induction of the capsular polysaccharide colanic acid synthesis. The introduction of a plasmid carrying skc fused with malE (gene encoding maltose-binding protein) also induced cps-lacZ expression, but intracellular expression of SK in E. coli did not. The cps expression by secretion of SK was diminished to the basal level in a cps-lacZ strain carrying a rcsC mutation. These results showed that the secretion of SK in E. coli induces colanic acid synthesis through the RcsC-dependent pathway. The N-terminal region of SK, at least Asn14-Thr147, was responsible for the induction of colanic acid synthesis in E. coli.
플라스미노겐의 활성화에 중요한 부위를 규명하기 위하여 스트렙토키나제의 N-말단에 대한 순차적 절단을 수행하였다. N-말단으로 부터 7개 및 13개의 아미노산이 제거된 스트렙토키나제의 플라스미노겐 활성화 능력은 야생형과 차이가 없었다. 그러나 20개의 아미노산이 제거된 스트렙토키나제의 활성은 야생형에 비해 4%로 줄어 들었다. 플라스미노겐과 20개의 아미노산이 제거된 스트렙토키나제의 동량의 혼합용액에서 이 복합체(플라스미노겐-스트렙토키나제)의 최대 활성은 혼합한후 4분에 나타났다. 이는 야생형 스트렙토키나제와 플라스미노겐의 복합체에서 보이는 최대 활성 유도시간과 똑같았다. 이 결과는 스트렙토키나제의 N-말단으로부터 20개의 아미노산을 제거한 스트렙토키나제의 플라스미노겐에 대한 결합 친화도가 감소되지 않았음을 보여주었다. N-말단으로 부터 15개의 아미노산을 제거한 스트렙토키나제가 활성을 보유하고 있다는 기존의 보고와 본 스트렙토키나제의 순차적 N-말단 절단 실험에서 얻어진 결과들은 세린16-발린20의 펩티드 부위가 플라스미노겐의 활성화에 중요함을 제안하였다. 이 부위에 존재하는 플라스미노겐 활성화에 중요한 잔기를 찾기 위해서 부위특이돌연변이 실험을 수행하였다. 16번 세린을 알라닌과 류신, 17번 글루타민을 알라닌과 류신, 18번 류신을 알라닌과 글루타민, 20번 발린을 알라닌과 글루타민으로 치환한 스트렙토키나제의 돌연변이체들은 야생형과 거의 비슷한 플라스미노겐 활성화 능력을 보였다. 그러나 19번 발린을 알라닌과 글루타민으로 치환한 돌연변이체들은 야생형에 비해 각각 57%와 32%로 감소되었다. 새로이 19번 발린을 류신과 아스팔틱산, 히스티딘으로 치환한 돌연변이체들은 야생형에 비해 각각 85%, 18%, 22%로 활성이 감소되었다. 스트렙토키나제의 19번 발린 잔기의 다섯가지 돌연변이체들을 동량의 플라스미노겐과 혼합시켰을때 최대 활성이 유도되는 시간은 야생형의 경우와 똑같이 4분으로 나타났다. CD 분석을 통해 이 돌연변이체들의 구조는 야생형과 차이가 없음을 확인하였다. 이들 결과들을 통해 최종적으로 스트렙토키나제의 19번째 잔기에서 비전하의 알킬기를 가지는 곁사슬이 플라스미노겐 활성화에 중요함을 확인하였다.
한편 스트렙토키나제가 대장균 K-12 균주에서 분비될때 그 균주가 콜라닉산(colanic acid)을 생성함을 발견하였다. 대장균에서 스트렙토키나제의 분비는 세포막에 존재하는 RcsC라는 막단백질을 자극하는 신호를 발생시키고 RcsC는 RcsB라는 세포내 단백질을 인산화 시킨다. 인산화된 RcsB는 콜라닉산의 합성에 관여하는 효소들의 전사를 촉진시킨다. 스트렙토키나제의 N-말단부위, 적어도 14번 아스파라긴산에서 147번 트레오닌에 이르는 부위가 콜라닉산 합성의 유도에 중요하였다.
