Staphylokinase (SAK) is a protein secreted from certain strains of Staphylococcus aureus. Staphylokinase is a plasminogen activator, which converts plasminogen to plasmin which decomposes fibrin clots. Staphylokinase gene has been cloned from chromosomal DNA of Staphylococcus aureus NCTC 10033 by polymerase chain reaction(PCR). The gene was subcloned into pUC19 and confirmed by nucleotide sequencing. The gene consisted of 408 base pairs encoding 136 amino acids. The staphylokinse gene was inserted into pKK-omp vector having a tac promoter and an ompA signal sequence. The resulting expression vector for staphylokinase was named pSAK. Expression of recombinant staphylokinase was qualitatively confirmed by skim-milk human plasminogen overlay test. Escherichia coli JM109 carrying pSAK expressed and secreted about 15mg/liter of recombinant staphylokinase into periplasmic space. The recombinant staphylokinase in the periplasm of E. coli JM109 was purified by using cold osmotic shock, DEAE-chromatography and CM-chromatography. The purified recombinant staphylokinase had the same amino acid sequence in the N-terminal region and plasminogen-activating activity as authentic staphylokinase. The recombinant staphylokinase was modified with methoxypolyethyleneglycol(mPEG) to reduce its antigenicity for therapeutic applications. In enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), mPEG-modified staphylokinse showed lower immuno-reactivity than that of unmodified staphylokinase
스타필로키나제는 뇌졸중, 관상동맥질환 등 혈전증 치료에 사용할 가능성이 있는 단백질로서, 몇몇 종류의 스타필로코쿠스 아우레우스로부터 분비되는 세포외 단백질이다. 혈액내의 플라스미노겐을 활성화시켜, 플라스민으로 전환시킨다. 이렇게 생성된 플라스민은 혈전을 용해시킨다. 스타필로키나제 유전자는 스타필로코쿠스 아우레우스(영국종균협회 10033)로부터 얻은 염색체 DNA로부터 중합연쇄반응에의하여 클로닝하였다. 클로닝된 유전자는 염기서열분석에의하여 확인되었다. 스타필로키나제 유전자는 408개의 염기쌍으로 이루어져 있고, 136개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 만들 수 있는 정보를 담고 있다. 스타필로키나제 유전자는 강력한 전사촉진제 tac과 대장균의 주변세포질로 분비되도록 ompA신호서열을 갖는 유전자발현 플라스미드에 끼워 넣어졌다. 재조합 스타필로키나제의 발현은 스킴밀크 휴먼 플라스민노겐 덧씌우기 실험으로 정성적으로 확인하였고, 15mg/liter의 재조합 스타필로키나제가 주변세포질에 발현, 축적되었다. 주변세포질에 축적된 스타필로키나제는 저온 삼투 충격, 음이온 치환 크로마토그래피법, 양이온 치환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하였다. 정제된 스타필로키나제는 아미노 말단의 아미노산 배열이 원래의 스타필로키나제와 동일하였고, 같은 플라스미노겐 활성화 활성을 갖고 있었다. 이러한 특성을 갖는 재조합 스타필로키나제는 혈전증 치료에 사용할 가능성이 있는 단백질이나, 우리 몸 안에서는 외래 단백질이므로 항원성을 갖고 있다. 본 연구에서는 발현 시켜 얻은 재조합 스타필로키나제를 메톡시폴리에틸렌글리콜을 이용하여 화학수정을 수행하였다. 수정된 재조합 스타필로키나제의 항원성 감소를 효소연결면역흡착기법(ELISA)을 통해 확인하였다. 플라스미노겐 활성화 역가도 같이 감소하였지만, 혈액내 투여시 수정시키지 않은 스타필로키나제보다 수정시킨 것이 시간의 경과에 따라 더 오래 잔존할 것으로 생각된다.