Escherichia coli RNase P, which catalyzed the processing of the 5'-termini of immature tRNAs, is composed of an RNA subunit (M1 RNA) and a protein subunit (C5 protein). The promoter region of the rnpB gene, which codes for M1 RNA, contains three promoter elements P-1, P-2, and P-3 in increasing distance from 5'-end of M1 RNA. In vivo and in vitro studies have shown that P-1 is the major site of transcription initiation of the rnpB gene. The P-1 promoter shares a consensus sequence with other promoters that can confer transcription repression upon the stringent response. The consensus sequence is located within the region (the discriminator region) between the -10 hexamer sequence and the transcription start site. The stringent response of the rnpB promoters was analyzed by directly observing metabolically unstable transcripts derived from the internally deleted rnpB gene harbored on a multicopy plasmid. Synthesis of the truncated transcripts was inhibited upon stringent condition induced by seryl-tRNA starvation, indicating that transcription of the rnpB gene is under negative stringent control. The inhibition of transcription was relA-dependent, which suggests that ppGpp is involved in the negative stringent response of rnpB transcription. Site-directed mutagenesis was carried out to examine the requirement of the rnpB promoter sequence for the stringent control. Mutant promoters were prepared by GC to AT substitutions at the discriminator region. The stringent response of the mutant promoters was examined both by analyzing synthesis of the truncated M1 RNA transcript upon seryl-tRNA starvation in vivo and by analyzing effects of ppGpp on in vitro transcription. The results showed that the discriminator region was responsible for the stringent control of the rnpB gene and the mutation of bases at different positions in the discriminator region differently affected the stringent response. Especially GC-rich sequences proximal to the transcription start site were more effective for generating stringent control signals. In vivo and in vitro footprinting assays with permanganate were performed to observe possible changes of the interaction of promoters and RNA polymerase or the structure of transcription initiation complexes during stringent control. There were no observable changes of the in vivo interaction before and after the stringent response in the wild type promoter as well as in the mutant promoter from which transcription was not repressed during the stringent conditions. However, the interaction patterns were quite different between the wild type promoter and the mutant promoter. Part of the difference was also observed in the in vitro interaction. These results imply that the structure of the transcription initiation complex in a stringently controlled promoter is intrinsically different from that of a relaxed promoter, even in the absence of the stringent response.
성숙되지 않은 tRNA의 5'-말단을 가공하는 효소인 대장균 RNase P는 RNA 소단위체 (M1 RNA)와 단백질 소단위체 (C5 단백질)로 구성되어 있다. M1 RNA를 코드하는 rnpB 유전자의 촉진유전자 영역에는 M1 RNA의 5'-말단에서부터 시작해서 P-1, P-2, 그리고 P-3 등, 세개의 촉진유전자가 존재한다. 생체내 및 시험관 내에서의 연구로부터 rnpB 유전자의 주된 전사 개시 위치는 P-1으로 밝혀졌다. P-1 촉진유전자는 긴축조절 조건하에서 전사 억제를 일으키는 다른 촉진유전자와 공통 염기배열을 공유한다. 그 공통 염기배열은 -10 헥사머 염기배열과 전사 시작점 사이의 영역 (구별 유전자)에 위치해 있다. rnpB 촉진유전자의 긴축 조절 작용은 다중복제 플라스미드에 포함되어 중간부분이 결실된 rnpB 유전자로부터 생산되는 불안정한 전사체를 직접 관찰하여 분석되었다. 이러한 전사체의 합성은 seryl-tRNA의 결핍에 의해 유도된 긴축조절 조건에서 저해되었다. 이와같은 전사의 저해는 rnpB 유전자의 전사가 음성적으로 긴축 조절된다는 것을 표시한다. 또한 이러한 조절은 relA-의존적이며, 이 결과는 rnpB 전사의 음성적 긴축 조절 작용에 ppGpp가 관여됨을 의미한다. 긴축 조절을 위해 필요한 rnpB 촉진유전자의 염기배열을 찾기 위해 특정자리 돌연변이화 반응을 수행하였다. 돌연변이 촉진유전자는 구별유전자 구역내에 있는 GC 염기쌍을 AT 염기쌍으로 치환시켜 만들었다. 돌연변이 촉진유전자의 긴축 조절 작용은 두가지 방법으로 연구하였다. 생체 내에서는 seryl-tRNA 결핍조건하에서 rnpB 유전자로부터 전사체의 합성을 관찰하였고, 시험관내에서는 시험관내 전사 반응중에서 ppGpp의 효과를 분석하였다. 이 결과로부터 구별유전자 구역은 rnpB 유전자의 긴축 조절을 위해 필요하고, 구별유전자 구역안에 있는 각 염기의 돌연변이는 긴축 조절에서 다르게 영향을 준다는 것을 알았다. 특히 전사 개시점에 근접한 GC 염기쌍은 긴축 조절 신호를 발생하는데 보다 효과적이었다. 긴축 조절 작용 동안에 일어나는 촉진유전자와 RNA 중합효소 간의 상호작용 변화 가능성이나 전사 개시 복합체의 구조를 관찰하기 위해 과망간산염을 이용한 생체내 및 시험관내 발자국법 실험을 수행하였다. 야생형 촉진유전자에서 긴축 조절의 전후에 생체내에서 상호작용의 변화는 관찰되지 않았다. 또한 긴축 조건 동안에 전사가 저해되지 않는 돌연변이 촉진유전자에서도 상호작용의 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 상호작용의 양상은 야생형 촉진유전자와 돌연변이 촉진유전자 사이에 매우 다르게 나타났다. 이와같은 차이점은 시험관내 상호작용에서도 일부 관찰되었다. 이 결과들은 긴축 조절을 하는 촉진유전자의 전사 개시 복합체는 비록 긴축 조절 환경이 아닐지라도 이완된 전사 개시 복합체와 본질적으로 다르다는 것을 의미한다.