It was cloned and sequenced light chain region of botulinum neurotoxin type B which is potent neurotoxin produced by Clostridium botulinum type B Lamanna. From amino acid sequences deduced from nucleic acid sequences, it was known that light chain of botulinum type B neurotoxin is composed of 441 codons and molecular mass is 58,827.5 Da. When the amino acid sequences of light chain was compared with that of other types of clostridial neurotoxin, BoNT/B has high similarity with BoNT/G and TeNT (61 % and 52 % similarity, respectively). These indicate that BoNT/B, BoNT/G and TeNT have a high genealogical relatedness.
Recombinant light chain was expressed and purified from E. coli with relatively simple chromatography using two ion exchange resin, DEAE-cellulose and phosphocellulose. The purified light chain actively cleaved the synaptobrevin of the mouse brain microsome. But when treated with metal chealating agent (EDTA or 2,2'-dipyridyl), the activity was inhibited. It was confirmed that the purified protein was light chain and was not contaminated with other protein with anti- recombinant light chain antibody obtained from rat. Native BoNT/B was also purified with APTG affinity chromatography which interacts with haemagglutinin moieties of neurotoxin complex and DEAE cellulose ion exchange chromatography.
When the activity of the recombinant light chain was compared with native BoNT/B in dose and time dependent manner, recombinant light chain have activity as same as that of native light chain. The activity of light chain was analyzed in various pH and salt concentration. The catalytic activity of the recombinant light chain was maintained stable from pH 3 to pH 9 but drastically decreased below pH 3.0 and above pH 9.0. The activity of light chain rapidly decreased in higher concentration than 0.2 M NaCl.
보튜리눔 신경독 B형 유전자의 Light chain 부분을 Clostridium botulinum Lamanna로부터 클로닝하고 유전자의 DNA서열을 결정하였다. DNA서열로써 유추된 아미노산 서열로부터 보튜리눔 신경독 B형의 Light chain은 모두 441 개의 codon들로 이루어져 있었고 그 분자량은 58,827.5 Da이라는 것을 알 수 있었다. B형 신경독 Light chain의 아미노산 서열을 다른 종류의 클로스트리디움 신경독들과 비교하였을 때, B형 독소는 G형과 파상풍 독소와 각기 61 % 와 52 %의 유사도를 보여서 아주 높은 상관 관계를 보였다. 이는 B형 신경독이 G형, 파상풍 독소와의 진화 유전학적인 관계가 다른 종류들과의 관계에 비하여 밀접하다는 것을 시사하는 것이다.
보튜리눔 B형 신경독의 Light chain을 대장균에서 발현시켜서 순수 정제를 하였다. DEAE-cellulose, Phosphocellulose라는 두개의 ion exchange resin을 사용하였다. 정제된 Light chian은 생쥐 뇌의 microsome에 존재하는 synaptobrevin을 자르는 단백질 분해 효소 반응을 보였고, 금속 이온을 흡착하는 성질을 갖는 EDT나 2,2'-dipyridyl(DPD)을 처리하면 그 효소 반응은 방해를 받았다. 정제된 단백질에 대한 항체를 백쥐에서 만들어서 여러 독소 단위체들과 반응시켰을 때, 항체는 native toxin의 light chain과 total chain을 인지하였다. 이 항체를 여러 가지 대장균의 추출액과 반응시켜서 정제된 이 Light chain이 다른 단백질과 전혀 혼합되지 않았다는 것을 확인하였다.
C. botulinum에서 native toxin을 순수 분리하였다. 이 순수 분리에는 신경독 복합체의 haemagglutinin과 결합하는 성질을 가진 APTG를 이용한 affinity크로마토그래피와 DEAE-cellulose resin을 사용하였다. 대장균에서 분리된 Light chain의 효소 반응성을 native toxin과 비교하였다. Light chain의용량과 시간에 따른 반응성을 보았을 때, 대장균에서 분리된 Light chain은 native toxin의 반응성과 같은 정도의 반응성을 보였다. Light chain의 효소 반응성의 변화를 여러 수소 이온 농도와 염의 농도에서 보았다. Light chain의 반응성은 pH 3.0과 pH 9.0 사이에서는 계속 유지되었지만 pH 2.0 이하나 pH 10.0 이상에서는 빠르게 감소하는 경향성을 보여 아주 넓은 수소 이온 농도에서 그 효소 반응성은 유지되었다. 영의 농도에 따른 반응성은 0.2 M 이상의 NaCl 농도에서 빠르게 감소하였다.
