Gap junctional communication during the progression of cell cycle from quiescent $G_0$ to S phase was examined in cultured clone 9 rat liver cells. The transfer of scrape-loaded fluorescent dye was suppressed immediately after the stimulation of cell cycle progression in a synchronized cell population. Intracellular pHs in clone 9 cells during $G_0$ / S progression were not virtually altered and thus acidification might be not the cause of gap junctional modulation. Northern blot analysis showed that the temporal disturbance of gap junctional communication in cells passing from $G_0$ to S phase did not result from transcriptional down- regulation of connexin 43. It was also found that the PKC inhibitor, calphostin C, was able to restore intercellular communication in serum stimulated cells. Data suggest a control mechanism by PKC mediated phosphorylation in the regulation of gap junction function which is vulnerable to cell cycling. The loss of gap junctional communication correlated with the increased phosphorylation of connexin 43 on serine residues in clone 9 cells. In an attempt to provide an evidence that phosphorylation of gap junction protein is directly related with the gating of gap junction protein, a single gap junction channel was reconstituted into an artificial liposome. The opening of gap junction channel was examined by means of sedimentation velocities in iso-osmolar density gradient. It was found that connexin phosphorylation by PKC gated the channels and dephosphorylation by CIP restored the gap junction permeability.
포유동물 세포가 세포 주기 중 휴지기($G_0$)로부터 DNA 복제기(S)로 진행하는 동안 세포간 직접적인 물질 이동을 통한 세포 신호 전달을 담당하는 '간극 연접' 단백질의 기능을 조사하였다. 간극 연접을 통한 물질 이동은 세포의 성장을 조절하는데 있어 중요한 역할을 담당할 것으로 예측되어져왔다. 쥐(레트)의 정상 간 세포주인 clone 9 세포를 이용하여 간극 연접을 통한 물질 이동을 조사하는 방법인 scrape-dye loaded method 법을 확립하였다. 이 실험법은 세포의 가운데 상처를 내고 이를 통해 유입된 형광물질이 주변세포로 전달되는 정도를 측정하는 방법이다. 간극 연접 기능의 특이적인 억제제인 heptanol을 처리하자 간극 연접을 통한 물질 이동이 감소하였으며 감소의 정도는 heptanol의 농도 증가에 따라 더욱 커졌다. 세포 주기의 진행에 따른 간극 연접의 물질 이동 정도를 측정한 결과, 휴지기에서는 활발한 물질 이동이 이루어지는 반면 세포의 성장 인자에 의한 세포분열 신호가 주어지는 직후부터 물질 이동이 급격히 억제되었으며 세포가 DNA 복제기로 진행함에 따라 물질 이동이 다시 재개됨을 관찰하였다. 간극 연접의 기능을 변화시키는 조절 요인을 찾기 위하여 여러 가지 조절 인자들에 대해 조사하였다. 세포 내 pH의 변화에 의한 조절 가능성을 알아보기 위하여 세포 배양액의 pH와 세포 내 pH의 변화를 살펴 보았으나 유의할 만한 변화는 나타나지 않았다. 간극 연접 단백질의 분해에 의한 조절 가능성을 알아보기 위하여 세포에 단백질 합성 억제제인 cycloheximid를 처리하고 간극 연접의 기능을 살펴본 결과, 합성이 억제된 후 4시간까지 50% 이상의 물질 이동이 계속 이루어지고 있었다. 또한, 물질 이동이 활발히 일어나는 세포와 물질 이동이 억제된 세포의 간극 연접 단백질의 양을 비교하기 위하여 세포를 방사성으로 표지하고 각각의 세포에서의 간극 연접 단백질 양을 비교하였는데 그 양은 그다지 변화하지 않았다. 간극 연접 단백질의 전사량 역시 복제기 이전까지 거의 같은 수준으로 유지되었다. 한편, 세포 주기 진행에 따라 간극 연접 단백질의 인산화도는 크게 변화하였다. 기능이 억제되는 동안 간극 연접 단백질의 세린기에 인산화량이 증가하고 비인산화된 간극 연접 단백질은 사라졌다. 또, 여러 세린 인산화 억제제를 세포주기를 진행하는 세포에 처리하고 물질 이동을 관찰하였다. 그 중, PKC의 억제제를 사용하여 인산화를 억제시킬 경우에만 간극 연접의 기능이 다시 회복된 한편, 물질 이동이 잘 이루어지고 있는 세포에 PKC 활성화제인 PMA를 처리한 경우, 간극 연접 단백질의 인산화와 함께 그 기능도 저해되었다. 또한, 세포 주기의 진행에 따라 PKC의 활성도를 관찰하였는데, 물질 이동이 가장 억제되었을 때 PKC의 활성도 역시 가장 높았다. 간극 연접 단백질의 여닫이를 PKC에 의한 직접적인 인산화로 조절되는 것인지를 알아보기 위하여 리포좀에 간극 연접 단백질을 재구성하였다. 리포좀에 재구성된 간극 연접 단백질을 PKC로 인산화 시키자 통로가 닫히고 그 인산화를 CIP로 탈인산화 시키자 통로가 다시 열렸다. 이러한 모든 실험 결과는 휴지기의 세포가 성장 신호를 받게 되면 세포 내 PKC가 활성화되고 활성화된 PKC는 간극 연접 단백질을 인산화 시켜 세포간의 물질 이동을 통한 신호 전달을 억제시킨다는 사실을 제시하고 있다.
