L-DOPA is a medicine for the treatment of parkinson's disease and there have been a lot of studies done to produce L-DOPA through biological process. To produce this high value chemical, the pathway catabolizing benzene to catechol and the pathway producing DOPA from catechol were hybridized using Metabolic Engineering Technology. At first, we determined optimal reaction condition for this hybrid pathway and applied this condition to E. coli carring the hybrid pathway through DNA manipulation. But, it is impossible to operate this system for a long time because of the toxicity of benzene. To solve this problem, we choosed pseudomonas as a host because of its resistance to solvent such as benzene, toluene, and 3mM benzene was fed intermitantly every 30minutes. We could produce 15mM L-DOPA for 9hrs through this system. As the expression level of Tyrosine Phenol Lyase was relatively low in Pseudomonas when compared to that of TPL in E. coli, rate-limiting step was the step at which catechol was converted to L- DOPA. So remaining catechol accumulated and this accumulation of catechol was also oxidized, catechol and its oxidant inhibited toluene dioxygenase attacking benzene non-competitively and as a result, the whole reaction stopped. We proposed and tried several ways in the process such as immobilization of cell, application to airlift reactor and the shift of temperature to prevent the accumulation of catechol and its oxidization, but all of these efforts didn't work out. We suppose that to solve this problem we have no choice but to fine some TPL of species having GC content and condon usage similar to Pseudomonas.
L-Dopa는 parkinson's diease의 치료제로 70년대초부터 생물공정으로 대채하려는 연구가 진행되어 90년대에 이르러 tyrosine phenol lyase에 의한 catechol, NH4+와 pyruvate로부터 L-DOPA를 생산하는 공정이 산업화되었다. 이 고부가의 약품을 생산하는 새로운 경로를 대사공학 기술를 통해서 만들었는데, catechol보다 훨씬 값싸고 대표적인 석유화학공업 폐기물 중의 하나인 benzene 으로부터 catechol을 생성하는 경로와 catechol로부터 L-DOPA를 생성하는 경로를 접목하였다. 이 경로를 E. coli에 적용한 결과 benzene의 toxicity때문에 cell이 깨지므로 3시간이상 operation이 불가능하였다. 이 점을 극복하기 위해서 host를 Pseudomonas로 바꾸고 benzene을 3mM/30min으로 낮게 feeding함으로서 최종적으로 9시간 동안 15mM의 L-DOPA를 생산하였다. 이 system에서의 율속단계는 catechol에서 L-DOPA를 생성하는 단계로 tyrosine phenol lyase의 활성이 낮아 catechol이 어느정도 축적되고, 이 축적물이 산화하면서 benzene을 attack하는 toluene dioxygenase를 불활성화시키는 것으로 나타났다. 이를 해결하기 위해서 공정상에서 고정화, airlift reactor에 적용, 온도 등의 여러 가지 시도를 하였으나 catechol의 축적과 산화를 막을 수는 없었다. 결국 tyrosine phenol lyase의 발현양이 E. coli에 비해서 Pseudomonas에서 훨씬 낮은 것으로 드러나 이 효소의 발현을 증가시킴으로서 해결된 것으로 생각된다.
